“點(diǎn)擊化學(xué)”（Click chemistry），又譯為“鏈接化學(xué)”、“動(dòng)態(tài)組合化學(xué)” （Dynamic Combinatorial Chemistry）、“速配接合組合式化學(xué)”，是由化學(xué)家巴里·夏普萊斯（K B Sharpless）在2001年引入的一個(gè)合成概念，主旨是通過(guò)小單元的拼接，來(lái)快速可靠地完成形形色色分子的化學(xué)合成。它尤其強(qiáng)調(diào)開(kāi)辟以碳-雜原子鍵（C-X-C）合成為基礎(chǔ)的組合化學(xué)新方法，并借助這些反應(yīng)（點(diǎn)擊反應(yīng)）來(lái)簡(jiǎn)單高效地獲得分子多樣性。

點(diǎn)擊化學(xué)應(yīng)用于藥物開(kāi)發(fā)和生物醫(yī)用材料等的諸多領(lǐng)域中，它已經(jīng)成為目前很為有用和吸引人的合成理念之一。

一、點(diǎn)擊化學(xué)的反應(yīng)原理

點(diǎn)擊化學(xué)指的是在一定環(huán)境條件（溫和、含水）下，一對(duì)功能性基團(tuán)彼此快速、有選擇性地相互反應(yīng)（“咔嚓”）。即兩個(gè)相兼容的具有點(diǎn)擊功能基團(tuán)A和B被激活^[1-5]，被激活的兩個(gè)分子形成穩(wěn)定的偶聯(lián)體。

形象比喻

}   “點(diǎn)擊”意味著用這些方法把分子片段拼接起來(lái)就像將搭扣2部分“喀噠”扣起來(lái)一樣簡(jiǎn)單。無(wú)論搭扣自身接著什么，只要搭扣的2部分碰在一起，它們就能相互結(jié)合起來(lái)，而且搭扣的2部分結(jié)構(gòu)決定了它們只能和對(duì)方相互結(jié)合起來(lái)。

點(diǎn)擊化學(xué)具有包括高選擇性、合成反應(yīng)快速、反應(yīng)條件簡(jiǎn)單，不使用溶劑或在良性溶劑中進(jìn)行，最好是水、副產(chǎn)物無(wú)害等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)^[6-8]、藥物開(kāi)發(fā)^[9]和材料學(xué)^[10]等領(lǐng)域。

水相點(diǎn)擊化學(xué)

1、點(diǎn)擊反應(yīng)容易在熱水中發(fā)生——可能是由于有機(jī)物分子在水中有著很高的分離速率常數(shù)，增強(qiáng)其反應(yīng)活性。

2、對(duì)環(huán)氧和氮雜環(huán)丙烷的親核加成要求有氫鍵的環(huán)境，所以水是很好的溶劑。

3、對(duì)于烯/炔-點(diǎn)擊反應(yīng)，需要可極化的親核/親電試劑，而水分子可以很好地將難極化的分子和易極化的分子區(qū)分開(kāi)來(lái)。

二、點(diǎn)擊化學(xué)的反應(yīng)特征

1、反應(yīng)模塊化。如疊氮和炔基都能生成含有三唑的化合物。

2、起始原料或反應(yīng)物易得。

3、反應(yīng)操作簡(jiǎn)單，條件溫和，對(duì)氧氣和水不敏感。

4、不需溶劑或用一些易于除去的溶劑，如水。

5、反應(yīng)具有立體選擇性，但不要求對(duì)映異構(gòu)選擇性。

6、產(chǎn)物易分離，后處理簡(jiǎn)單。反應(yīng)收率高，副產(chǎn)物少。

7、產(chǎn)物在生理?xiàng)l件下穩(wěn)定。

8、原料易的，高產(chǎn)率，區(qū)域/立體專(zhuān)一性。

三、點(diǎn)擊化學(xué)的反應(yīng)類(lèi)型

特殊生物分子標(biāo)記要求反應(yīng)過(guò)程可在生理?xiàng)l件（中性ph、水溶液、室溫）和低反應(yīng)物濃度下進(jìn)行，在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間范圍確保無(wú)毒性和低本底的標(biāo)記，同時(shí)保留生物學(xué)功能。在多余的可能性反應(yīng)中，一般只有少量符合反應(yīng)的必要性、選擇性和生物相容性條件。

點(diǎn)擊化學(xué)歸為兩類(lèi)：銅催化和無(wú)銅反應(yīng)。

（1）銅（I）催化疊氮化物-炔烴反應(yīng)（Cu(I)- catalyzed Azide - Alkyne Click Chemistry reaction，CuAAC）；

（2）力引發(fā)的的疊氮-炔基偶合反應(yīng)（Strain-promoted Azide - Alkyne Click Chemistry reaction，SPAAC）；

（3）四氮雜苯-反式環(huán)辛烯連接反應(yīng)（Tetrazine–trans- Cyclooctene Ligation，TCO）。

反應(yīng)（1）依賴(lài)Cu（I）離子催化進(jìn)行反應(yīng)，而反應(yīng)（2）和（3）可在無(wú)金屬離子條件下進(jìn)行反應(yīng)。

比較知名的無(wú)銅疊氮化物-磷化氫反應(yīng)（施陶丁格連接）由于受到磷化氫的不穩(wěn)定性和反應(yīng)遲緩的限制，目前研究重心主要轉(zhuǎn)移到力引發(fā)的的疊氮-炔基偶合反應(yīng)—TCO連接反應(yīng)。

四、如何選擇合適的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)？

一般來(lái)說(shuō)，我們根據(jù)選擇性、反應(yīng)性、生物相容性和穩(wěn)定性選擇合適的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)。

1. Cu(I)-catalyzed Azide-Alkyne Click Chemistry (CuAAC) reaction^[1]

這是常用的反應(yīng)，一個(gè)功能化的疊氮化物分子A和功能化末端炔烴分子B反應(yīng)，通過(guò)一部分苯三唑形成穩(wěn)定的A-B結(jié)合物（圖2）。

由于末端炔烴與疊氮化物基本不會(huì)發(fā)生反應(yīng)，CuAAC反應(yīng)效率主要依賴(lài)金屬催化劑，如帶+1電荷的氧化態(tài)Cu（I）。也可使用不同的銅來(lái)源和還原劑，如與連接抗壞血酸的CuSO4 提供Cu(II) 鹽也應(yīng)用于大部分生物分之標(biāo)記中^[11,12]。

CuAAC反應(yīng)在活性細(xì)胞中的應(yīng)用受到Cu（I）離子毒性的限制，通過(guò)使用Cu（I）螯合配體如THPTA可以解決這個(gè)問(wèn)題，它可提供雙重作用：（1）通過(guò)維持Cu（I）氧化狀態(tài)促進(jìn)CuAAC反應(yīng)；（2）保護(hù)生物分子免受氧化性損傷。

如果你要開(kāi)始建立和優(yōu)化CuAAC反應(yīng)體系，可參考Presolski ^[11] 和 Hong ^[12] 提供的通用方法。

特點(diǎn)：

ü   小型的疊氮化物和炔烴具有優(yōu)良的底物性質(zhì)

ü   試驗(yàn)適用條件的優(yōu)化（類(lèi)型&銅來(lái)源、還原劑和銅配體)

ü   適用于對(duì)銅毒性不礙事的實(shí)驗(yàn)(不推薦用于體內(nèi)或活細(xì)胞標(biāo)記)

反應(yīng)速率較慢（相對(duì)其它兩種反應(yīng)）

2. Strain-promoted Azide-Alkyne Click Chemistry (SPAAC) reaction

銅離子的細(xì)胞毒性常常限制了CuAAC反應(yīng)的應(yīng)用。無(wú)銅離子和非毒性的疊氮化物標(biāo)記方法是SPAAC反應(yīng)^[3]，它通過(guò)使用相對(duì)末端炔具有顯著減少活化能的環(huán)辛炔（strained cyclooctynes），因此不需要外源的催化劑^[13]。

 許多結(jié)構(gòu)多種多樣的環(huán)辛炔衍生物（如DIFO、BCN、DIBAC、DIBO、ADIBO）已經(jīng)研制出來(lái)，在反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和親水性方面差異很大。我們的SPAAC結(jié)合化學(xué)是以雜氮芐基-環(huán)辛炔反應(yīng)為基礎(chǔ)的(ADIBO = DBCO = DIBAC)（圖3）。

基于雜氮芐基-環(huán)辛炔(ADIBO=DBCO)的試劑具有高反應(yīng)活性和足夠的親水性^[14,15]，因此低本底功能性疊氮化物分子標(biāo)記^[16]甚至比CuAAC反應(yīng)效率更高。而且疊氮化物-DBCO反應(yīng)選擇性高 ，因此理想地適合和四氮雜苯-反式環(huán)辛烯連接反應(yīng)進(jìn)行雙重標(biāo)記方法^[17]。

特點(diǎn)：

ü   檢測(cè)小分子疊氮化物比CuAAC反應(yīng)更快

ü   不需要銅離子，無(wú)毒性

ü   沒(méi)有催化劑或者配體，因此無(wú)需大量的條件優(yōu)化

ü   適合與四氮雜苯-反式環(huán)辛烯連接反應(yīng)進(jìn)行雙標(biāo)記方法

3. Tetrazine-trans-Cyclooctene Ligation

  四氮雜苯-反式環(huán)辛烯連接反應(yīng)組成一種快速、無(wú)毒性生物分子標(biāo)記方法，可理想的用于體內(nèi)細(xì)胞標(biāo)記和低濃度使用。一個(gè)功能化四氮雜苯分子A和一個(gè)功能化反式環(huán)辛烯（TCO）分子B反應(yīng)，從而通過(guò)一部分二氫毗嗪形成一個(gè)穩(wěn)定的A-B結(jié)合物（圖4）。

一些結(jié)構(gòu)多樣的烯烴和四氮雜苯衍生物在反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和穩(wěn)定性方面具有很大的不同。TCO與四氮雜苯的反應(yīng)活性較高^[18,19]。

四氮雜苯衍生物與TCO的反應(yīng)活性取決于位置3（圖4，R₁）和位置6 (圖4，R₂)的取代基。目前已篩選出2種不同反應(yīng)活性和穩(wěn)定性的四氮雜苯，以滿(mǎn)足不同的要求。如果快速反應(yīng)動(dòng)力學(xué)是主要因素，四氮雜苯 (R₁=phenyl, R₂=H) 試劑是理想的選擇，而6-甲基-四氮雜苯 (R₁=phenyl, R₂=CH₃) 試劑則適用于化學(xué)穩(wěn)定性要求較高的反應(yīng)^[18]。

特征：

ü   快速點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，適合體內(nèi)細(xì)胞標(biāo)記和低濃度反應(yīng)。

ü   無(wú)需銅離子，無(wú)毒

ü   無(wú)催化劑或者配體，不需大量的條件優(yōu)化

適用于與力引發(fā)的疊氮-DBCO偶合反應(yīng)^[17]

五、點(diǎn)擊化學(xué)試劑的選擇

Overview of available CLICK Reagents

Selected References

[1] Kolb et al. (2001) Click chemistry: diverse chemical function from a few good reactions. Angew. Chem. Int. Ed. 40 (11):2004. [2] Sletten et al. (2009) Bioorthogonal Chemistry: Fishing for Selectivity in a Sea of Functionality. Angew. Chem. Int. Ed.48:6998. [3] Jewett et al.(2010) Cu-free click cycloaddition reactions in chemical biology. Chem. Soc. Rev. 39(4):1272. [4] Best et al. (2009) Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochemistry.48:6571. [5] Lallana et al. (2011) Reliable and Efficient Procedures for the Conjugation of Biomolecules through Huisgen Azide–Alkyne Cycloadditions. Angew. Chem. Int. Ed. 50:8794.

[6] Grammel et al. (2013) Chemical Reporters for biological discovery. Nature Chemical Biology 9:475. [7] Xie et al. (2013) Cell-selective metabolic labeling of biomolecules with bioorthogonal functionalities. Current Opinion in Chemical Biology 17:747. [8] Su et al. (2013) Target identification of biologically active small molecules via in situ methods. Current Opinion in Chemical Biology17:768. [9] Zeng et al. (2013) The Growing Impact of Bioorthogonal Click Chemistry on the Development of Radiopharmaceuticals. J Nucl Med 54:829. [10] Evans et al. (2007) The Rise of Azide–Alkyne 1,3-Dipolar 'Click' Cycloaddition and its Application to Polymer Science and Surface Modification. Australian Journal of Chemistry 60(6):3

[11] Presolski et al. (2011) Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Click Chemistry for Bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology 3:153.

[12] Stanislav et al. (2009) Analysis and Optimization of Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition for Bioconjugation. Angew. Chem. Int. Ed. 48:9879.